Alzheimer Doctoral Scholarship

Jan Filip Hasecke arbeitet seit Juni 2017 an seiner Promotion in der AG Hoyer im Institut für Physikalische Biologie an der Heinrich-Heine Universität Düsseldorf. Seine Dissertation befasst sich mit der Entwicklung eines neuen Wirkstoffes gegen Alzheimer. „Bei Alzheimer wird angenommen, dass der Auslöser der Krankheit die Verklumpung verschiedener Proteine im Gehirn zu toxischen Aggregaten ist, welche letztlich das Absterben der Neurone auslösen. Um dieses Problem zu lösen entwickle ich in meiner Doktorarbeit eine neue Wirkstoffart: proteolytische Antikörper. Diese besitzen die Spezifität von Antikörpern, jedoch zusätzlich ein katalytisches Zentrum, wie etwa Enzyme. Diese Antikörper sollen Aggregate erkennen und gleichzeitig zerschneiden können und somit unschädlich machen. Das Besondere dabei ist, dass die proteolytischen Antikörper unverändert aus der Reaktion herausgehen und anschließend ungehindert weitere Aggregate abbauen können. Dies verspricht eine enorme Effizienzsteigerung gegenüber bisherigen Antikörpertherapien in klinischen Studien. Besonders gefällt mir an der Arbeit, dass sie aus vielen kleinen Baustellen besteht, wodurch es stetig zu vielen kleinen Teilerfolgen kommt. Vor allem aber ist die Aussicht, tatsächlich etwas an dem Problem der Alzheimer Krankheit verändern zu können, eine treibende Kraft hinter diesem Projekt.“

Der Forschungsschwerpunkt meiner Doktorarbeit ist der molekulare Mechanismus der frontotemporalen Lobärdegeneration (FTLD). FTLD gehört wie die Alzheimer Erkrankung zu den neurodegenerativen Erkrankungen und ist zudem die zweithäufigste Form präseniler Demenz. Wie auch bei Alzheimer leiden betroffene Patienten unter der Bildung von Proteinablagerungen im Gehirn, welche, aufgrund der betroffenen Hirnbereiche, vor allem zu Sprachstörungen und auch zu Verhaltensauffälligkeiten und Persönlichkeitsänderungen führen können. FTLD kann sowohl sporadisch als auch in einer genetisch vererbten Variante auftreten. Um sowohl eine sichere Diagnostik als auch eine Therapie der Krankheit zu ermöglichen, ist es wichtig, dass wir zuerst die molekularen Mechanismen verstehen, die die Krankheit verursachen. Die Krankheits-assoziierten Gene könnten dabei ein entscheidender Schlüssel sein.

Eines dieser krankheitsspezifischen Gene ist Progranulin. FTLD relevante vererbte oder spontan erworbene Veränderungen in diesem Gen führen häufig zu einer starken Reduzierung des Progranulin Proteins (PGRN). PGRN scheint eine wichtige Rolle  bei Entzündungsprozessen, der Wundheilung und dem Zellwachstum zu spielen. Es wurde außerdem beschrieben, dass ein kompletter Verlust des Proteins im Körper zu einer lysosomalen Speicherkrankheit, der neuronalen Ceroid-Lipofuszinose, führt. Zudem wurde festgestellt, dass auch in Mausmodellen der FTLD die Expression von lysosomalen Proteinen verändert ist. Deshalb wird vermutet, dass PGRN zusätzlich zu den bereits bekannten Funktionen, eine wichtige Aufgabe bei dem Abbau zellulärer Proteine hat. In meinem Projekt werde ich daher den Einfluss von PGRN auf die Aktivität lysosomaler Enzyme untersuchen. Zudem werde ich die funktionellen Konsequenzen von zwei bisher unbekannten Mutationen im GRN Gen untersuchen.

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disorder that selectively affects motor neurons. Approximately 5 to 10 % of cases are familial (fALS) and result from inherited genetic mutations, such as those affecting the gene Fused in Sarcoma (FUS). The FUS protein is a crucial regulator of multiple cellular functions, including stress granule (SG) formation as well as RNA binding and processing. Aggregates of FUS are a hallmark of FUS-ALS, but the role of these aggregates in disease pathogenesis is not clear. This question remains unresolved because the majority of studies have used cellular models incapable of recapitulating the complex biology of motor neurons (MNs). As a result, no therapeutics are available to prevent or slow ALS pathogenesis. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) provide a revolutionary approach to model ALS because they can be differentiated into a theoretically limitless number of patient-specific MNs.
In order to investigate ALS in vitro, our lab previously used CRISPR/Cas9-mediated gene editing to generate isogenic WT and P525L FUS-eGFP iPSCs. In line with existing reports, P525L FUS showed preferential abnormal cytoplasmic localization, and high content imaging performed on arsenite-stressed cells linked the mutation to altered SG dynamics. Using the GFP sequence as an affinity tag, we performed a preliminary pull down experiment on iPSC-derived MNs to explore FUS interactors, and identified protein partners interacting differentially with WT and P525L FUS. Because some of the detected proteins have been associated with ALS when mutated, we consider this as a strong clue that something relevant for the disease is happening at this level, and speculate that such interactions are integral to the induction of FUS-ALS. We propose to further investigate protein-protein interactions in this model to identify which players may be crucial for disease pathogenesis.
To determine if ALS pathology is induced via gain- or loss-of-function, we will either knock down or overexpress these proteins in iPSC-derived MNs, and evaluate the impact on ALS pathological phenotypes. Our hope is to shed some light on the mechanisms involved in disease pathogenesis, thereby facilitating the discovery of novel therapeutic approaches. Since pathological aggregation of proteins is a key feature of ALS, – and FUS inclusions have been reported also in sporadic cases, indicating a common pathological denominator – it may be possible, in the future, to develop these findings into therapeutics for most ALS patients.

FUNCTIONAL ANALYSIS OF PHOSPHOLIPASE D3 (PLD3) IN ALZHEIMER´S DISEASE

Alzheimer´s disease (AD) is the most common form of progressive dementia in the elderly, for which several genetic risk factors have been described. Previously, a whole-exome sequencing study identified that a rare coding variant in the phospholipase D3 (PLD3) gene confers a two-fold risk factor in the development of AD, affecting the turnover and cleavage products of the Amyloid Precursor Protein (APP). PLD3 contains two conserved HKD motifs. As a result, it has been classified as a member of the phospholipase D family, together with the well characterized phospholipases D1 and D2. However, to date, no canonical activity or substrate has been described for PLD3.
Our group has described PLD3 as a transmembrane protein transported throughout the secretory and endocytic pathway. In early endosomal compartments, PLD3 co-localizes with APP. PLD3 is then proteolytically processed to a soluble form in acidic compartments to finally reach lysosomes. Our data indicate that PLD3 transport to lysosomes is mediated via the endosomal sorting complex required for transport (ESCRT) where previous ubiquitination of lysine residues is required for sorting into intraluminal vesicles (ILVs).
In brains derived from Pld3-deficient mice no changes of APP full length levels nor its cleavage products, including amyloid beta (Aß), were found. However, microgliosis in the dentate gyrus of the hippocampus together with a depression-like behavior was observed. As part of this project our Pld3 KO mouse will be bred into an established AD mouse model (Pld3-/-5xFAD). We believe that the AD-related phenotypes of this well described mouse strain will help us to decipher the effect of the absence of Pld3 on the turnover, transport and processing of APP, by performing cell biology and biochemical approaches, e.g. culture of primary neurons and immunohistochemistry. Previous data have shown that APP is also ubiquitinated and transported to ILVs via de ESCRT pathway to further be degraded in lysosomes, therefore, ubiquitination and MVB-dependent sorting of Pld3 in cell lines and primary neurons will be also investigated.
We hypothesize that Pld3 affects the sorting of APP in late endosomal-/lysosomal compartments and thereby its proteolytic cleavage and degradation is affected leading to an accumulation of Aß plaques and further increasing the probability to develop AD.

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is an adult-onset disorder characterized by progressive paralysis caused by the degeneration of motor neurons (MNs). Although most cases are sporadic, about 10 % are familial and caused by genetic mutations in genes such as SOD1, FUS, and C9ORF72. Transgenic mice expressing mutant SOD1 recapitulate hallmarks of ALS pathology including MN degeneration, mitochondrial dysfunction, aggregation of SOD1 protein, progressive paralysis, and shortened lifespan. Because mitochondria play a critical role in cell survival, many groups have sought to protect MNs from degeneration by protecting mitochondrial function from ALS pathology. However, paralysis in ALS patients is not the result of MNs degeneration, but, rather, degeneration of neuromuscular junctions (NMJs), which later progresses to MN loss. As a result, any therapies aiming only at preserving MN survival are likely to have no effect on ALS pathogenesis. Instead, it is essential to focus on preserving NMJ structure and function.
iPSCs are poised to revolutionize our understanding of ALS and to enable the identification of novel therapeutics. Through reprogramming, iPSCs can be derived from an ALS patient with a specific phenotype and genotype. ALS iPSC-derived MNs can then be used to recapitulate the disease pathogenesis of the donor patient. Using gene correction, isogenic iPSCs have been generated from ALS patients with mutant SOD1 and demonstrate that iPSC-derived MNs from ALS patients recapitulate ALS relevant phenotypes in vitro.  Because NMJ loss is the initial cause of paralysis in ALS patients, we argue that a scalable platform for modeling NMJ dysfunction using iPSCs would be a powerful tool to identify novel ALS therapeutics.
The project aims at developing and validating a platform technology to enable NMJ-based models of ALS for compound screening. Together with the research group of PD Dr. Dr. Andreas Hermann we have designed and are manufacturing a prototype plate that connects MNs and myotubes in a highly reproducible pattern that is scalable and compatible with high – throughput screening (HTS). We propose to develop this tool and using it to generate a first – in – class model of ALS based on NMJ function. We aim at incorporating electrodes into our plates to enable HTS of NMJ function. We previously generated iPSC lines from ALS patients with mutations in FUS and C9ORF72 and are performing gene correction on these mutations to generate isogenic iPSC lines. We propose using these MNs differentiated from these isogenic iPSC lines to test, through use of our novel plates, the effects of ALS mutations on NMJ degeneration, which is directly comparable to the initial event causing paralysis in patients. Finally, we propose performing a pilot screen of 1000 known tool compounds to validate both the use of our plates and NMJ degeneration as a screening platform. The results of this project could facilitate ALS research and give insight into new therapies.

Mein Forschungsschwerpunkt sind die molekularen Mechanismen der Frontotemporalen Demenz (FTD) und Amyotrophen Lateralsklerose (ALS). Diese neurodegenerativen Erkrankungen sind eng verwandt mit der Alzheimerschen Krankheit. Da jedoch andere Nervenzellen vom Zelltod betroffen sind, kommt es anders als bei Alzheimer nicht zum Gedächtnisverlust, sondern zu einer fortschreitenden Veränderung der Persönlichkeit, des Sprachvermögens oder der Muskulatur. FTD und ALS sind bislang unheilbar und führen nach einigen Jahren unweigerlich zum Tode. Auf molekularer Ebene zeichnen sich beide Erkrankungen durch eine abnorme Umverteilung und Aggregation bestimmter Proteine aus; diese Proteinaggregate können sowohl im Zytosol als auch im Zellkern von Nervenzellen vorkommen. Zwei Proteine, die in den Proteinaggregaten gefunden wurden, sind TDP-43 (TAR DNA-binding protein of 43 kDa) und FUS (Fused in sarcoma). Beide Proteine erfüllen vielfältige Aufgaben in Zellen und es ist bekannt, dass Mutationen im TDP-43- und FUS-Gen erbliche Formen der ALS und gelegentlich auch FTD verursachen können. Wie es zur pathologischen Umverteilung und Aggregation von TDP-43 und FUS kommt und wie dies zum Krankheitsbild der FTD und ALS führt, konnte bislang nicht geklärt werden.  Meine Doktorarbeit widmet sich dem Export von TDP-43 und FUS aus dem Zellkern. Im Normalzustand sind beide Proteine hauptsächlich im Zellkern von Zellen lokalisiert. Kleine Mengen an TDP-43 und FUS können aber auch in zytosolischen Fortsätzen detektiert werden, was auf den Export beider Proteine aus dem Zellkern ins Zytosol hindeutet. Über welche Transportwege TDP-43 und FUS aus dem Zellkern exportiert werden, ist noch unerforscht. Das Ziel meiner Doktorarbeit ist es, mit Hilfe von zell- und molekularbiologischen Untersuchungen herausfinden, wie der Kernexport von TDP-43 und FUS in gesunden Zellen abläuft, um dann eventuelle Export-Veränderungen im Zusammenhang mit FTD und ALS feststellen zu können. Ich hoffe, dass meine Arbeit uns neue Einblicke in die molekularen Mechanismen der FTD und ALS gewährt und einen kleinen Beitrag zum besseren Verständnis dieser Krankheitsbilder leistet.

Primary progressive aphasia (PPA) is a clinical label for a heterogeneous group of diseases and syndromes in which a neurodegenerative disorder presents with aphasic symptoms in the initial stages. To date, PPA research has focused on brain imaging, neuropsychology, and biochemical markers of the disease and virtually nothing is known about the neurophysiology of PPA. Simple language-based tasks will be administered to gain insight into the neurophysiology of language processing in PPA patients with the target of identifying different spatio-temporal signatures of language processing in the various degenerative diseases that cause PPA. The absence or degradation of signal components leads to specific disabilities (=symptoms) in language processing. The project will use the non-invasive techniques of event-related magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG). This neurophysiology project will be embedded as a sub-project in a large prospective study of PPA (n=200) with a multi-disciplinary team investigating neuropsychology and imaging (MRI and PET) of PPA. The specific aim of this project is to create an electrophysiological landscape of the various forms of PPA. The deeper understanding of language processing can inform mechanistic understanding of PPA subtypes and offers potential to identify biomarkers that could differentiate between the different pathologies that can cause PPA both for diagnosis and monitoring symptomatic interventions. Furthermore, detailed information about the spatio-temporal pattern of language processing in PPA is fundamental for the future development of treatment options like speech therapy and might lead to treatment approaches with transcranial magnetic stimulation (TMS).

Alzheimer’s disease (AD) is the most common age associated form of dementia. Yet, the pathology of the disease is to date not well understood on a molecular level. While some cases of AD have a genetic underpinning, the majority of the AD cases (95%) is sporadic. The most realistic approach in the short term is a treatment to delay the onset and thus improve life quality for the affected and cut treatment costs significantly. Notably, it is commonly accepted that late onset AD is a result of variable combination of genetic and environmental risk factors. This puts epigenetic mechanisms in the spotlight for the search for novel treatments, since here environmental factors are translated into molecular alterations. The precise mechanisms how epigenetic processes control memory function are however only beginning to emerge. A finding important for my PHD project is that alterations in histone 4 at lysine 12 actetylation (H4K12ac) were linked to the pathogenesis of Alzheimer’s disease (Peleg et al, 2010). How H4K12ac is regulated during memory formation is however not understood. Moreover, it is completely unclear by which signals neuronal activity is coupled to altered epigenetic gene-expression in the nucleus. In preliminary experiments we performed a proteomic screen using SILAC technology to identify proteins that specifically bind to H4K12ac in neurons. We found a number of proteins that that are known chromatin readers, hence proteins that read the epigenetic code for example by binding to specific epigenetic modifications which initiates subsequent events that control gene-expression. The most interesting proteins were the so called Bromodomain containing proteins (BRD), BRD2 and BRD4. The function of BRD proteins in the adult brain is so far completely unknown but in other cellular systems it has been shown that BRD2 and BRD4 specifically bind to H4K12ac. Further preliminary data shows that pharmacological inhibition of BRD2/4 binding to H4K12ac in the adult hippocampus enhances memory function in mice. The host lab has generated mice that allow the conditional deletion of BRD2 in mice (Brd2 cKO mice) and Brd4 cKO mice will shortly be available. In my PhD thesis I will analyse cognitive function in Brd2/4 cKO mice. To this end I will generate mice that lack Brd2/4 in excitatory or inhibitory neurons of the adult brain and subject these animals to behavior testing including the analysis of memory function (fear conditioning, water maze, T-maze, Y-maze, novel object recognition), anxiety (Elevated plus maze, open field) and sensory motor gating function (pre pulse inhibition of startle response). I will combine the behavior data with a molecular analysis of gene-expression and chromatin plasticity. During my PhD work I want to analyse Brd2/4 levels in AD, study the role of Brd2/4 in memory formation and AD. But also investigate the cellular pathways regulated by Brd2/4 during cognition, as well as the chromatin-distribution of Brd2. And further I want to analyse Brd2-dependent chromatin marks and gene-expression. In conclusion my PhD thesis is based on solid preliminary evidence and will address for the first time to role of chromatin readers in memory formation. Peleg S, Sananbenesi F, Zovoilis A, Burkhardt S, Bahari-Java S, Agis-Balboa RC, Cota P, Wittnam J, Gogul-Doering A, Opitz L, Salinas-Riester G, Dettenhofer M, KAng H, Farinelli L, Chen W, Fischer A (2010) Altered histone acetylation is associated with age-dependent memory impairment in mice. Science 328: 753-756

In einer immer älter werdenden Gesellschaft steigt die Anzahl von Menschen mit neurodegenerativen Erkrankung wie Morbus Parkinson (MP) rapide an. Parkinson ist die zweithäufigste neurodegenerative Krankheit bei Erwachsenen: Einer von tausend Europäern über dem Lebensalter von sechzig erkrankt an diesem Leiden. Bei Parkinsonpatienten sterben über den Zeitraum von mehreren Jahrzehnten die Nervenzellen in der substantia nigra pars compacta, ein für den Bewegungsapparat entscheidender Teil im Gehirn, ab, die normalerweise den Neurotransmitter Dopamin produzieren dopaminerge Neuronen im Mittelhirn, mDA Neurone). Bisher erhältliche Medikamente können allerdings nur symptomatische Linderung verschaffen, indem sie den Verlust von Dopamin ausgleichen. Derzeit sind demnach keine Wirkstoffe bekannt, die die Krankheitsursache direkt angehen und verhindern können. Daher hat die Entwicklung neuer Substanzen höchste Priorität. Wir schlagen als innovative Therapiemöglichkeit die Modulierung der Aktivität der Leucine-rich repeat kinase (LRRK2) vor. Mutationen im LRRK2-Gen sind die am häufigsten nachgewiesene genetische Ursache für MP, allerdings ist der exakte molekulare Mechanismus bisher unbekannt. Obwohl LRRK2 in den letzten Jahren im Fokus der Parkinsonforschung steht, ist nur wenig über die Funktion des Gens in Erfahrung gebracht worden. Das LRRK2-Protein wird in Nervenzellen produziert, es kann mit einer Vielzahl von anderen Proteinen interagieren und es besitzt eine enzymatische Kinase-Aktivität, katalysiert also Prozesse innerhalb einer Zelle. Bereits vor einiger Zeit hingegen ist als grundlegendes Prinzip entdeckt worden, wie Zellen ihre Proteine regulieren und an- bzw. ausschalten können, um so die verschiedenen Prozesse innerhalb einer Zelle zu steuern. Zellen erreichen dies unter anderem durch Modifikation von bestimmten Stellen im Protein, indem z. B. eine Phosphatgruppe an eine Aminosäure gekoppelt wird Phosphorylierung. Für das LRRK2-Protein wurden über dreißig dieser Stellen festgestellt, und konsistent mit dieser Idee findet man bei Patienten mit MP-verursachenden LRRK2 Mutationen abnormale Modifikationen am LRRK2-Protein, die die enzymatische Aktivität von LRRK2 verändern. Diese abnormalen Phosphorylierungen führen dazu, dass Nervenzellen im Zellkultur- und Tiermodell neuronale Phänotypen zeigen und absterben. Modifiziert man hingegen diese abnormalen Modifikationen ist es möglich, die Nervenzellen vor Zerstörung zu retten. Daher ist es wahrscheinlich, dass die beobachteten Veränderungen von LRRK2 auch beim Patienten eine wichtige Rolle in der Krankheitsentstehung Pathogenese von MP spielen. Die exakte Funktion für die meisten der bekannten Phosphorylierungsstellen bei LRRK2 ist unklar, insbesondere bei den im Patienten betroffenen mDA Neuronen. Um besser zu verstehen, wie die Phosphorylierung von LRRK2 und die MP-Pathologie mechanistisch verbunden sind, haben wir ein in vitro Zellmodell entwickelt, welches ein frühes Stadium der MP-Pathogenese im Patienten darstellt. In diesem Modell erzeugen wir mDA Neuronen aus Stammzellen, die wir von Parkinsonpatienten hergeleitet haben (induzierte pluripotente Stammzellen, iPSCs). Die so erzeugten Zellen werden in verschiedenen Methoden dazu genutzt, um den Einfluss und die Funktion der Phosphorylierungsstellen unter verschiedenen Bedingungen wie Stress oder genetische Faktoren zu testen.

Mutations in the Parkin gene are responsible for the majority of autosomal recessive parkinsonism. Parkin is an E3 ubiquitin ligase with a wide neuroprotective activity. It can maintain mitochondrial integrity and prevent cell death under various stress conditions. Recently, Parkin has been shown to be implicated in the mitochondrial quality control by inducing the removal of damaged mitochondria via mitophagy.
During the last few years, Parkin has also been linked to cancer, as mutations in the Parkin gene were found in several cancer types. The cancer studies suggest a role of Parkin as a tumor suppresssor gene (TSG). In contrast, studies from PD research demonstrate an anti-apoptotic effect of Parkin under stress conditions. These two observed activities of Parkin – TSG activity on the one side and neuroprotective activity on the other side – led us to ask the question, if common or different pathways are involved in these seemingly opposing activities of Parkin. One possibility might be that the two activities are regulated by different types of ubiquitination of target molecules, as Parkin is known to be an E3 ubiquitin ligase.
The expected results of this project may help to understand mechanisms related to two common disease entities of high medical relevance – neurodegeneration and cancer. Moreover, insight into the function of Parkin could be of interest to develop novel therapeutic strategies for Parkinson’s disease.

Neurodegenerative Erkrankungen wie die Alzheimersche Erkrankung gehören noch immer zu den ganz großen Herausforderungen in der Wissenschaft. Sie stellen eine enorme sozioökonomische Belastung mit einem hohen medizinischen Aufwand dar.

Die Alzheimersche Erkrankung ist die häufigste neurodegenerative Erkrankung des Menschen und zugleich die häufigste Ursache einer Demenzerkrankung im Alter. Die Ursachen dieser schweren Erkrankung sind bis zum heutigen Zeitpunkt noch nicht geklärt und es gibt keine effektive Prävention bzw. Therapiestrategie. Die klinischen Symptome und die Neurodegeneration werden durch die Bildung von extrazellulären senilen Plaques, überwiegend bestehend aus dem Peptid Amyloid-ß (Aß), einem Spaltprodukt des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) hervorgerufen. Neben den Plaques stellen die neurofibrillären Bündel oder auch Tangles das zweite Charakteristikum dar. Hauptbestandteil der Tangles ist das Mikrotubuli-assoziierte Protein Tau.

Diese pathologischen Strukturen führen u.a. zu einem Absterben umliegender Neuronen. Noch vor jeder fibrillären Ablagerung, sind lösliche molekulare Aggregate des Amyloid-ß (z. B. Dimere und Oligomere) wahrscheinliche Auslöser von pathologische Kaskaden, die zu neurodegenerativen Prozessen führen. Bei der Alzheimerschen Krankheit und anderen neurodegenerativen Prozessen wird in der Literatur beschrieben, dass die Neuronen eine verstärkte Expression von Zellzyklus-Proteinen (Cyklin-abhängige Kinasen (CDKs), Cycline, Proliferationsmarker, Cdk-Inhibitoren (CDKis)) aufweisen. Das ist ein Hinweis für einen Wiedereintritt der differenzierten Neuronen in den Zellzyklus, dieser kann jedoch nicht vollständig durchlaufen werden und es kommt zur Apoptose. Vermutlich treiben verschieden mitogene Faktoren eine Aktivierung von Signaltransduktionskaskaden an, verbunden mit einer Störung der Zellzyklusaktivierung. Es wurde bereits beschrieben, dass auch Amyloid-ß Oligomere mögliche Auslöser für einen Wiedereintritt der Neuronen in den Zellzyklus sein können und somit diese an neuronalen Zelltod beteiligt sind. Die Kontrolle des Zellzykluses erfolgt durch Cyclin-abhängigen Kinasen, die wichtige Funktionen in den einzelnen Zellzyklus-Phasen einnehmen. Zudem erfolgt die Regulation der CDK/Cyclin-Aktivität über eine Reihe von Phosphorylierungs- oder Dephosphorylierungsereignissen und durch die Wirkung von CDK-Inhibitoren. Diese Inhibitoren binden und hemmen den Cdk-Cyclin-Komplex. Es ist bekannt, dass Cyklin-abhängige Kinasen wie CDK4, CDK6 und CDK1 an pathologischen Phosphorylierungsprozessen beteilligt sind und die CDK4 auch eine wichtige Rolle bei der Induktion von neuronaler Apoptose spielt. Das Konzept dieses Projektes basiert auf der Hemmung des Wiedereintritts der Neuronen in den Zellzyklus durch eine Runterregulierung der CDK1-, CDK4- & CDK6- Aktivität mittels transgener Expression ihrer physiologischen Inhibitoren. Es wurde bereits durch transgene Ansätze gezeigt, dass die gezielte Überexpression von p16INK4a in in vivo Modellen der Neurodegeneration, neuroprotektive Effekte erzielt. Unser Ziel in diesem Projekt ist es, ein neues gentherapeutisches Werkzeug zu entwickeln, welches eine sichere, langanhaltende, neuronspezifische und regulierbare Transgenexpression mit neuroprotektiven Hintergrund garantiert. Als Basis für das Genshuttlesystem sollen nicht integrierende lentivirale Vektoren verwendet werden. Die zellspezifische Expression der CDKis werden unter Kontrolle eines neuronspezifischen Promotors stehen. Der Vektor kann je nach Expressionslevel des Transgens weiter modifiziert werden. Ist eine Erhöhung der Expression erforderlich, so kann eine verstärkte Promotoraktivität z. B. über Fusion mit einem CMV- (Cytomegalievirus) Enhancer (Hybrid-Promoter) oder Einbau des WPRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element) erreicht werden. Die Regulierung der Transgenexpression soll durch das Tet-on/off-System gesteuert werden. Die Blut-Hirnschranke stellt eine bedeutende Hürde für eine vektorvermittelte Gentherapie in das Gehirn dar. Diese Hürde soll u.a. mittels convection-enhanced-delivery (CED) überwunden werden. Die neuentwickelten Vektoren, sollen in verschiedenen transgenen Mäusen mit amyloid-ß Pathology getestet und dabei die CDK4 und CDK6 Aktivität spezifisch in Neuronen reguliert werden. Die Effekte dieser gentherapeutischen Anwendung sollen u.a. im Hypocampus und im Neocortex mittels verschiedenen Markern (neuronal, microglia, astrolglia) quantifiziert und analysiert werden.

Frontotemporale lobare Degeneration (FTLD) ist die zweithäufigste Ursache von Demenz bei Menschen unter 65 Jahren. Die Krankheit äußert sich u.a. in einer Veränderung der Persönlichkeit und des zwischenmenschlichen Verhaltens und wird durch einen fortschreitenden Verlust der Neuronen im frontalen und temporalen Kortex charakterisiert.
FTLD-TDP, die größte Untergruppe von FTLD, weist Ubiquitin-immunreaktive neuronale cytoplasmatische oder nukleäre Einschlüsse auf, die als Hauptkomponente das TAR DNA-Bindeprotein-43 (TDP-43) enthalten.
• Identifikation von Arzneimitteln, welche die Expression von Progranulin erhöhen und somit dem Haploinsuffizienz-Phänotyp von FTLD-Patienten mit Progranulin-Mutationen entgegenwirken
• Charakterisierung des Risikofaktors TMEM106B und Untersuchung des Zusammenhangs zwischen TMEM106B und Progranulin in FTLD

Morbus Alzheimer (AD, „Alzheimer’s disease“) ist eine neurodegenerative Erkrankung und tritt vorwiegend im Alter auf. AD ist durch eine Abnahme der Gehirn- und Gedächtnisleistung gekennzeichnet und wird durch den Verlust von Neuronen, neurofibrillären Versteifungen und extrazellulären Ablagerungen des Amyloid-β (Aβ) Peptids zu senilen Plaques in betroffenen Gehirnregionen charakterisiert. Bis heute wird eine zentrale Rolle des Aβ1-42 Peptids bei der Alzheimer Pathogenese angenommen. Bisher wurden viele Bemühungen für die Elimination des Peptids unternommen, einer ist der Transport über die Blut-Hirn-Schranke (BBB, „blood brain barrier“). Die BBB grenzt das zirkulierende Blut vom Gehirn ab und spielt dabei eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns. Desweiteren ist sie essentiell für die Versorgung des Gehirns mit Nährstoffen und verhindert den Transport vieler toxischer, aber auch therapeutischer Substanzen. Am Aufbau der Blut-Hirn-Schranke sind Endothelzellen, die feste Zell-Zell-Verbindungen (sogenannte „Tight Junctions“), sowie Astrozyten und Perizyten beteiligt. Die Endothelzellen exprimieren eine Vielzahl von spezialisierten Transportern und Rezeptoren, die für die Nährstoffversorgung des Gehirns wichtig sind. Bis heute wurden auch verschiedene Proteine identifiziert, die am Transport von Aβ Peptiden über die BBB beteiligt sind. Eines dieser Proteine ist das P-Glycoprotein (P-gp). P-gp ist ein ATP-abhängiger Transporter, der u.a. eine große Rolle bei der Elimination von Medikamenten aus dem Gehirn spielt. In einem Teilprojekt soll die Rolle von P-gp am Transport von Aβ über die BBB detaillierter untersucht werden, um weitere mögliche Ansätze für die Behandlung von AD zu entwickeln. Neben der Eliminierung von Aβ aus dem Gehirn ist ein weiterer Ansatz die Veränderung der Aβ1-42 Produktion im Gehirn. 2001 wurde gezeigt, dass NSAIDs (nichtsteroidalen Antirheumatika, „non steroidal anti inflammatory drugs“) die Aktivität der -Sekretase modulieren und selektiv die Produktion von Aβ1-42 senken können. Allerdings können diese Substanzen die BBB nicht überwinden. Kürzlich konnte aber gezeigt werden, dass nicht-permeable Substanzen, die an HSA („human serum albumin“) Nanopartikel gebunden sind, über die BBB transportiert werden können. Mit Hilfe dieser Nanopartikel könnte es möglich sein dass NSAIDs die BBB überwinden und die Produktion von Aβ1-42 in Alzheimer Patienten spezifisch modulieren können.

Die Alzheimer-Krankheit (AK) ist die häufigste Form der senilen Demenz und ist charakterisiert durch einen progressiven und irreversiblen Verlust von Erinnerung und kognitiver Leistungsfähigkeit. Charakteristisch für die Erkrankung sind amyloide Plaques und Neurofibrillen in Hirnproben von betroffenen Patienten. Amyloidplaques sind Aggregate der amyloid β-Peptide (Aβ) und die Entstehung dieser löst nach derzeitigem Kenntnisstand eine Kaskade molekularer Ereignisse aus, die letztlich zu neuronalem Zelltod und der klinischen Manifestierung der AK führen. Aβ-Peptide werden durch schrittweise Proteolyse des amyloid precursor proteins (APP) generiert. Zunächst wird APP von der β-secretase BACE hydrolysiert und in einem Schritt werden Aβ-Peptide durch Intramembranprotelyse freigesetzt. Dieser Schritt wird vom so genannten γ-Sekretase-Komplex katalysiert. Preseniline (PS) sind die aktiven Proteine in diesem Komplex und gehören zu einer Familie von Intramembranproteolyse-vermittelnden Aspartylproteasen. Diese tragen ein GxGD-Motiv in ihrem aktiven Zentrum und umfassen außer den Presenilinen auch die Signalpeptidpeptidase (SPP) und SPP-ähnliche Proteasen (SPPLs). Angesichts der Rolle der γ-Sekretase bei der Entstehung der AK stellt diese Proteasefamile ein viel versprechendes therapeutisches Ziel dar. Im Zuge dieser Arbeit soll die atomare Struktur von humanem SPPL3 mittels Röntgenkristallographie aufgeklärt werden. Dies wird Einblicke in katalytische und mechanistische Eigenschaften dieser Proteasefamilie ermöglichen und angesichts der Homologie zu PS wird dies besonders für die Wirkstoffentwicklung von großer Bedeutung sein. Außerdem sollen mittels Mutagenese die Determinanten der Substratselektivität dieser Familie untersucht werden. Sehr auffällig ist außerdem, dass PS, anders als SPP/SPPLs, nicht endoproteolysiert wird und diese Diskrepanz wird experimentell untersucht. Diese Arbeit wird damit Einblicke in die grundsätzlichen Prinzipien der Intramembranproteolyse der GxGD Aspartylproteasen ermöglichen und wird damit zu unserem heutigen Verständnis der anfänglichen molekularen Ereignis der Entstehung von Morbus Alzheimer erheblich beitragen.

Zusammenfassung der Promotion “Zum Verständnis der Rolle von Rer1 beim Zusammenbau der g-Sekretase“

Die g-Sekretase ist ein Proteinkomplex mit großem Molekulargewicht bestehend aus den 4 Untereinheiten Presenilin (PS), Nicastrin, Aph1 und Pen2. Der fertige g-Sekretasekomplex zeigt die Aktivität einer Protease und spaltet verschiedene Substrate wie das Amyloid-Vorläuferprotein (APP) innerhalb ihrer Transmembrandomänen. Dadurch vermittelt die g-Sekretase den letzten Schritt in der Produktion des Amyloid-b-Peptides (Ab). Ab ist die Hauptkomponente der Amyloidplaques in den Gehirnen von Alzheimer Patienten.

Der g-Sekretasekomplex assembliert sich im endoplasmatischen Retikulum (ER) und wird anschließend zu den Orten der g-Sekretaseaktivität transportiert. Eine Qualitätskontrolle stellt sicher, dass nur vollständig und korrekt assemblierte g-Sekretase das ER verlässt. Nach unserer Hypothese liegen diesem Mechanismus ER-Retentionssignale zu Grunde, welche die nicht-assemblierten Untereinheiten im ER zurückhalten. Durch den Zusammenbau des Komplexes werden diese Signale maskiert und der Komplex interagiert nicht länger mit Proteinen, welche die ER-Retention vermitteln. Wir haben bereits in den Untereinheiten PS1 und Pen2 ER-Retentionssignale identifiziert, welche innerhalb der Transmembranbereiche der Proteine liegen. Des Weiteren haben wir das Protein Rer1 identifiziert, dass die ER-Retention der Untereinheit Pen2 über eine Transmembrandomäneninteraktion vermittelt. Deshalb vermuten wir, dass Rer1 durch seine Interaktion mit Pen2 einen Einfluss auf den Zusammenbau der g-Sekretase hat. Im vorgeschlagenen Projekt wollen wir den molekularen Mechanismus des Zusammenbaus des g-Sekretase näher untersuchen. Insbesondere wollen wir die Rolle von Rer1 bei diesem Prozess aufklären. Es wird ein siRNA Screen durchgeführt, um Interaktionspartner der transmembranbasierten Retention zu identifizieren. Zu diesem Zweck werden wir Reporterproteine verwenden, welche Rer1-abhängig im ER zurückgehalten werden. Die Lokalisation dieser Reporterproteine dient als Sensor für die Integrität der Rer1-basierten Qualitätskontrolle. Zellen, die diese Reporterproteine stabil exprimieren, werden mit einer siRNA-Bank transfiziert. Anschließend wird die Lokalisation der Reporterproteine über High Content Mikroskopie analysiert. Zusätzlich werden wir nach direkten Interaktionspartnern von Rer1 suchen. Dazu werden wir einen auf einer humanen Gehirn-cDNA-Bank basierenden Hefe-Zwei-Hybrid-Screen durchführen. Es ist wahrscheinlich, dass wir in den beschriebenen Screens Proteine identifizieren, welche den Qualitätskontrollmechanismus für die g-Sekretase beeinflussen. Diese Proteine werden dann näher untersucht, um ihre exakte Funktion beim Zusammenbau der g-Sekretase aufzuklären.

Die Akkumulation des Amyloid ß-Peptides (Aß) ist eines der beiden typischen neuropathologischen Merkmale der Alzheimer´schen Erkrankung. Aß entsteht bei der proteolytischen Prozessierung des Amyloid Vorläuferproteins (ßAPP) durch zwei spezifische membrangebundene Proteasen. Allerdings wird die Aß Menge im Gehirn nicht nur durch die Aktivität der Proteasen festgelegt, die an der Produktion von Aß beteiligt sind, sondern auch durch Enzyme, die Aß abbauen können. Unter ihnen spielen vor allem Zink-Metalloproteasen eine große Rolle, wie zum Beispiel das Insulin abbauende Enzym IDE, die Endothelin-konvertierenden Enzyme ECE-1 und -2 und das Typ II Membran Protein Neprilysin (NEP). So konnte gezeigt werden, dass eine Erhöhung der NEP Expression bzw. der NEP Aktivität einen verstärkten Abbau von Aß und eine Verringerung der Aß Ablagerungen zur Folge hat. Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollen die molekularen Mechanismen identifiziert werden, die den subzellulären Transport und die Aktivität von NEP regulieren. Mit Hilfe von biochemischen und zellbiologischen Methoden soll vor allem die Rolle der NEP Phosphorylierung untersucht werden. In ersten Untersuchungen, konnte gezeigt werden, dass NEP sowohl in vitro, als auch in vivo phosphoryliert wird. In den folgenden Untersuchungen werde ich mich vor allem auf die Charakterisierung des zugrunde liegenden Signalweges, der darin mitwirkenden Proteinkinasen und der Bestimmung der NEP Phosphorylierungsstelle konzentrieren. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass der Somatostatinsignalweg die NEP Aktivität und Lokalisation beeinflussen kann. Hier wird zu untersuchen sein, ob die NEP Phosphorylierung an diesem Prozess beteiligt ist. Die Ergebnisse dieses Promotionsprojektes sollten neue Einblicke in die molekulare Regulation und den Aß Abbau durch NEP geben, so dass eventuell neue therapeutische Ansätze gefunden werden können, die zu einer Reduzierung der Aß Menge und somit auch der Aß Ablagerungen im Gehirn führen würden.

In Deutschland leben derzeit über eine Million Menschen, die an einer Demenz erkrankt sind. Nach Schätzungen der World Health Organisation sind Demenzen wie z. B. die Alzheimer´sche Erkrankung die vierthäufigste Todesursache bei Personen über dem 60. Lebensjahr. Es ist bisher unklar, welche die genauen Ursachen für die Entstehung einer Demenz sind. Es wird jedoch angenommen, dass alle Demenzen einen gemeinsamen Entstehungsmechanismus aufweisen. Eine Schlüsselrolle bei einer Vielzahl neurodegenerativer Erkrankungen spielt dabei die Akkumulation von fehlgefaltetem Protein. Die Akkumulation von fehlgefaltetem Protein ist ein dynamischer Prozess, der in einer Störung des Gleichgewichts zwischen Proteinsynthese und -abbau resultiert. Das Ergebnis ist eine Proteinaggregation in den Zellen, die als Ursache für eine darauf folgende Demenz angesehen wird. Die familiäre Enzephalopathie mit Neuroserpineinschlüssen (FENIB) ist eine erbliche Erkrankung des Gehirns, die schon in frühen Stadien des Lebens zu Demenz führt. Ein Protein, das dem Neuroserpin sehr ähnlich ist, findet sich im Fadenwurm Caenorhabditis elegans (C. elegans). Durch Veränderung des natürlicherweise vorkommenden Proteins, ist es möglich die Erkrankung im Wurm nachzustellen und mit bestimmten Methoden zu untersuchen. Im lebenden Wurm können gezielt einzelne Proteine abgeschaltet werden und somit bestimmte Signalwege, die mit dem Protein interagieren, aufgeklärt werden. Ebenso ist es möglich, im lebenden Organismus Substanzen zu testen, die den Beginn der Erkrankung verhindern oder verzögern sollen. Das Ziel meiner Doktorarbeit ist es Signalwege zu finden, die im Abbau von aggregiertem Protein eine Rolle spielen. Hierfür haben wir ein C. elegans basiertes Modell generiert, in dem aggregationsanfällige Mutanten mit einem Fluoreszenzprotein gekoppelt sind. Dies erlaubt uns im lebenden Organismus Gene zu analysieren und Substanzen in einem hohen Durchsatz zu testen. Die erzielten Ergebnisse können dann auf ein Zellkultursystem und auf ein bereits etabliertes Mausmodell übertragen werden. Daten aus diesen Studien werden dazu beitragen neue Mechanismen des Proteinabbaus bei Demenzen aufzuklären.